細跑凍存與復蘇注意事項

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，利用凍存技術將細胞冷凍保存在-196C℃液氮中，可以使細胞暫時停止生長并保留細胞特性，以便在需要時再復蘇細胞用于實驗。同時保存適量的細胞，可以防止細胞在培養(yǎng)過程中因受到污染或其他意外事件導致細胞丟種，起到細胞保種的作用。

一、冷凍"慢條斯理"，復蘇“眼疾手快"

細胞凍存和復蘇采取"慢凍快融"的原則，慢速冷凍可使細胞內的水份滲出細胞外，減少細胞內形成冰晶的機會;快融以保證細胞外結晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細胞內，再次形成胞內冰晶造成對細胞的損傷。

二、“高高M興上班，平平安安回家"

細胞凍存時需向培養(yǎng)基中加入冷凍保護劑，可保護細胞在冷凍時免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑可根據(jù)其是否穿透細胞膜分為滲透性和非滲透性兩類:

1、滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子物質，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

2、非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要包括蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。

三、細胞凍存的“按部就班"

1、準備已滅菌的凍存培養(yǎng)液，并4℃預冷;

2、選取對數(shù)生長期的細胞，棄掉細胞培養(yǎng)液，用細胞消化酶（如胰蛋白酶）進行消化，適時去掉消化液，加入少量新鮮培養(yǎng)液。懸浮生長的細胞不進行消化處理，直接將細胞收集于離心管中離心，1000 rpm，5-10 min;

3、棄去上清液，逐漸加入適量預冷的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調節(jié)細胞濃度在5×106~1×107/mL之間;

4、將上述細胞分裝于2 mL凍存管中，每管1-1.5 mL。在凍存管上標明細胞名稱、凍存日期和操作者;

5、凍存∶標準的降溫速率開始為-1~-2C/ min，當溫度降到-8O℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20°℃冰箱2h，然后放入-80°℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

四、細胞復蘇的“按部就班"

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃水浴中，并不時搖動使其盡快融化;

2、從37C水浴中取出凍存管，在無菌條件下取出細胞，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻，以1000 rpm，5-10min離心;

3、棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調整細胞密度后接種到培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);4、次日更換—次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

五、前方高能預警

1、配制好的細胞凍存液要進行預冷，新鮮配制的凍存液會產(chǎn)生大量的熱。

2、凍存的細胞在半年后，建議取出一只凍存管細胞復蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。

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